荧光分光光度计可不能乱用,先看看这些知识吧

发布时间:

2020-02-12 00:00


荧光分光光度计的工作原理
采用脉冲氙灯作光源(1μs半宽)保证测量结果有很好的重复性。高档精密仪器配置:激发光部分和荧光发射部分,分别采用900条/mm凹面衍射光栅。检测器采用高灵敏度高光电倍增管,倍增信号送计算机处理,最后将分析结果转入显示器的屏幕上显示。
 
由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后,此光即为荧光物质的激发光,被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光,经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上,由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪,激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制,当测绘荧光发射光谱时,将激发光单色器的光栅,固定在最适当的激发光波长处,而让荧光单色器凸轮转动,将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上,所记录的光谱即发射光谱,简称荧光光谱。
当测绘荧光激发光谱时,将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处,只让激发光单色口的凸轮转动,将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪,所记录的光谱即激发光谱。
 
当进行样品溶液的定量分析时,将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处,将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处,由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。
 
荧光分光光度计操作和使用
 
硬件操作
荧光分光光度计在使用时,需要注意开机次序,以保护设备之间不受影响。荧光光谱仪开机顺序一般为先开氙灯,然后开仪器主机,最后开跟仪器连接的计算机。如此操作的原因在于稳态氙灯是高压点亮,为了避免瞬问脉冲电流对周围设备造成影响,需要先开氙灯,等电流稳定后再打开周边的电脑等设备。关机顺序则相反。
 
软件操作
荧光定量分析多采用工作曲线法,即以已知量的标准物质,按试样相同方法处理后,配成一系列标准溶液,测定其相对荧光强度和空白溶液的相对荧光强度;扣除空白值后,以荧光强度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制工作曲线;然后将处理后的试样配成一定浓度的溶液,在同一条件下测定其相对荧光强度,扣除空白值后,从工作曲线上求出荧光物质的含量。
 
在用荧光分析法测定某些会引起荧光改变的微量物质时,常采用差示荧光法,可使荧光强度的读数差距拉大,使荧光强度的降低加大,从而提高方法的灵敏度和准确度。下面以日立F-4500荧光分光光度计的使用为例,具体介绍如何在仪器上进图谱扫描、浓度分析等定性、定量测试操作。
 
测试注意事项
荧光强度容易受外界因素的影响,如样品池、激发光源、温度、溶液的pH值、溶剂性质、其它溶质、表面活性剂等都会造成荧光强度的变化。严格控制测试条件对荧光分析来说至关重要。
 
①样品应盛在四面透光的石英比色皿(荧光池)中,如果是挥发性样品应使用带塞的荧光池。
②在荧光分析时,为了得到稳定可靠的数据,一般需要开机预热氙灯大约30min。如果仪器光源采用的是闪烁氙灯,预热时间可以缩短到10min左右。对某些易感光、易分解的荧光物质,尽量采用长波长、低入射光强度及短时间光照。
③温度变化可引起荧光强度的改变。通常降低温度,有利于提高荧光量子产率,荧光强度增大。温度影响荧光强度的显著程度因样品而异,大部分荧光物质的荧光强度受温度影响不大,测试温度变化不超过±3℃,对测试结果几乎无影响。
④当荧光物质是弱酸或弱碱时,溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中,分子和离子的电离平衡会发生改变,而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。以苯胺为例:在pH=7~12的溶液中会产生蓝色荧光,在pH<2或pH>13的溶液中都不产生荧光。再如,维生素B2(核黄素)在430~440nm蓝光照射下会发出绿色荧光,λem为535nm。它在pH=6~7的溶液中荧光强度最大,而在pH=11时荧光消失;但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnOt氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素,并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。
⑤分子结构中存在ππ共轭的荧光物质在极性溶剂中,荧光效率显著增强。溶液表面活性剂的加入能够显著提高荧光强度。仪器房应注意经常通风,避免产生的臭氧在室内富集。
 
使用荧光分光光度计要注意以下这些:
 
1、光源不要频繁开关
光源是仪器的重要组成部分且光源也有一定的使用寿命,所以在使用的过程中最好不要频繁的去开关,如果光源被关掉就要注意在光源完全冷却了之后再重新开启,切不要刚刚关掉又立即将光源打开,这样容易让光源的寿命受到折损。此外,在日常使用时尽量要用手直接去触摸光源,若不慎留下指纹应该使用擦镜纸沾无水酒精擦拭。
 
2、样品室要经常清洁
使用经常会将样品室弄脏,如果不及时擦拭干净就会影响测试分析甚至会光度计造成损坏。所以,平时使用仪器的时候就要特别注意保护好样品室,如果有样品将其污染就要及时使用洗耳球吹扫或进行擦拭。
 
3、光电倍增管要保持无尘
光电倍增管也是荧光分光光度计中的重要组成部件,使用仪器期间要注意经常清洁光电倍增管的外壳确保外壳没有灰尘积累,因为光电倍增管是一种光敏原件,灰尘会对其敏感性造成不良影响,除了灰尘之外还要注意不要用手直接去触摸外壳避免留下油脂和皮屑。

版权所有 © 2022 上海棱光技术有限公司 SEO

网站建设:中企动力 上海