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荧光分光光度计测试注意事项

日期:2017-02-07 09:38

 

荧光强度容易受外界因素的影响,如样品池、激发光源、温度、溶液的pH值、溶剂性质、其它溶质、表面活性剂等都会造成荧光强度的变化。严格控制测试条件对荧光分析来说至关重要。
①样品应盛在四面透光的石英比色皿(荧光池)中,如果是挥发性样品应使用带塞的荧光池。
②在荧光分析时,为了得到稳定可靠的数据,一般需要开机预热氙灯大约30min。如果仪器光源采用的是闪烁氙灯,预热时间可以缩短到10min左右。对某些易感光、易分解的荧光物质,尽量采用长波长、低人射光强度及短时间光照。
③温度变化可引起荧光强度的改变。通常降低温度,有利于提高荧光量子产率,荧光强度增大。温度影响荧光强度的显著程度因样品而异,大部分荧光物质的荧光强度受温度影响不大,测试温度变化不超过±3℃,对测试结果几乎无影响。
④当荧光物质是弱酸或弱碱时,溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中,分子和离子的电离平衡会发生改变,而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。以苯胺为例:在pH=7~12的溶液中会产生蓝色荧光,在pH<2或pH>13的溶液中都不产生荧光。再如,维生素B2(核黄素)在430~440nm蓝光照射下会发出绿色荧光,λem为535nm。它在pH=6~7的溶液中荧光强度最大,而在pH=11时荧光消失;但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMn04氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素,并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。
⑤分子结构中存在π-π共轭的荧光物质在极性溶剂中,荧光效率显著增强。溶液中表面活性剂的加入能够显著提高荧光强度。
⑥瑞利散射和拉曼散射是溶剂的两种散射光,应注意不要误把瑞利散射和拉曼散射光谱当做荧光光谱。瑞利散射光波长与激发光波长相同,拉曼散射与激发光波长不同,而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关,因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分开。在测试时选择合适的狭缝宽度,或者空白扣除,也可以对散射光的影响进行校正。
⑦荧光物质分子与溶液中其它物质分子之间作用导致荧光强度降低,常见的荧光猝灭剂,如卤素离子、重金属离子、02、硝基化物质、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象,因此,在较严格的荧光实验中必须除02。
⑧测试过程中注意不要肉眼盯着氙灯光源看,以防对眼睛造成损伤。
⑨仪器房应注意经常通风,避免产生的臭氧在室内富集。

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