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荧光分光光度计同步荧光法说明

日期:2016-12-07 09:48
荧光分光光度计同步荧光法按光谱扫描方式的不同可分为恒(固定) 波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。
1. 恒波长同步荧光分析法
恒波长同步荧光法系在扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持固定的波长间隔(Δλ= λem- λex = 常数) ,即通常所说的同步荧光法,是最早提出的一种同步扫描技术。在恒波长同步荧光法中,Δλ的选择十分重要,这将直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度。在可能条件下,选择等于斯托克斯位移的Δλ。
恒波长同步荧光光谱法较多用于多组分多环芳烃的同时测定。多环芳烃性质很相似,尽管有强的荧光,但各种化合物的激发和发射光谱往往光谱重叠严重,用经典荧光法难以进行混合物的直接分析。同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点,可用于多组分多环芳烃混合物的同时测定。
2. 恒能量同步荧光分析法
恒能量同步荧光光谱法(CESLS) 由Inman 和Winefordner 于1982 年提出。它在克服拉曼光、提高分析灵敏度方面均有显著效果,具有其他同步荧光法所没有的独特优点。恒能量同步荧光法系在激发波长λex和发射波长λem的同时扫描过程中保持两者一恒定的能量差Δ€v 关系。该法以荧光体的量子振动跃迁的特征能量为依据来进行同步扫描,若选择一固定能量差Δ€v 等于某一振动能量差,则在同步扫描中,当激发能量和发射能量刚好匹配一特定吸收2发射跃迁条件时,该跃迁处于最佳条件,由此产生的同步光谱可达最大强度。恒能量同步荧光法对于多环芳烃的鉴别和测定特别有利。恒能量同步荧光法的光谱优点可以以定量形式来表达并用来选择扫描参数,从而为体系的参数优化提供了便利。
3. 可变角同步荧光分析法
可变角同步荧光法是在测绘同步光谱时,使激发和发射两个单色器以不同的速率或方向同时扫描。该方法可分为线性与非线性两类:线性可变角同步荧光法的扫描路径表现在等高线图中为一条不为45°的直线;而非线性可变角同步荧光法其扫描路径表现在等高线图中为折线或任意曲线。非线性可变角同步荧光扫描时,不但要求激发、发射两个单色器能以不同的速率和不同的方向进行扫描。该方法能使扫描路径方便地有选择性地通过各点,因而获得极佳的光谱分辨。李耀群等提出了利用可变角同步荧光法克服二次散射光干扰的设想,并且探讨了适宜于包括可变角同步荧光光谱在内的波长域同步谱的理论计算式。导数技术和可变角同步荧光法的联用可进一步提高分析的灵敏度和选择性
4. 恒基体同步荧光分析法1994 年Murillo2Pulgarin 等提出了恒基体同步荧光法。它也可被认为是非线性可变角同步荧光法的一种,其扫描路径在等高线图中表现为一曲线,巧妙的是该曲线是基体(将干扰物视为基体) 的等荧光强度线。该方法一般与导数技术联用[113 ] ,沿着等高线扫描,再结合导数技术就可以消除基体的干扰。其基本原理是:在等高线图上把基体的荧光强度相等的各点连接起来形成等高线(等荧光强度线) ,沿着基体的等高线扫描,则在整个扫描过程中基体的荧光强度相等。由于整个扫描过程基体的荧光强度一致,当结合导数技术微分后,基体的导数信号为零。在混合物中沿着测定路径(干扰物或基体的等高线) 扫描时所得的信号通常是混合物的总的荧光信号,既包括待测物的信号,又包括干扰物(基体) 的信号。但由于是沿干扰物(基体) 的等高线扫描,荧光信号求导后,干扰物(基体) 的干扰就得到了消除,扫描所得的导数信号则是被测物的净信号。
 
荧光分光光度计同步扫描技术是由Lloyd首先提出的,它与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长。由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长) 构成光谱图,称为同步荧光光谱。同步荧光法按光谱扫描方式的不同可分为恒(固定) 波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。

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